پاورپوینت واکنش زنجیره ای پلیمراز (pptx) 32 اسلاید
دسته بندی : پاورپوینت
نوع فایل : PowerPoint (.pptx) ( قابل ویرایش و آماده پرینت )
تعداد اسلاید: 32 اسلاید
قسمتی از متن PowerPoint (.pptx) :
Polymerase chain reaction
واکنش زنجیره ای پلیمراز
مقدمه
تشخيص، تمايز و شناسايي ميكروارگانيسم ها مي تواند توسط روش هاي متعددي از جمله آزمايش هاي فنوتيپی، بيوشيميايي و ايمونولوژيكي انجام شود.
البته این روشها به دلیل اینکه گاهی نتایج واضح و قابل استنادی ندارند ,همچنین اینکه نیازمند صرف وقت زیادی می باشند تقریبا با روشهای جدید شناسایی که به وسیله تکنیک های مولکولی انجام میشوند جایگزین گردیده اند.
افزايش حساسيت و فرآيند اختصاصي تشخيص, احتمال خطا در اين روش ها را نسبت به روش هاي فنوتيپي و بيوشيميايي تا حد زیادی كاهش مي دهد.
تاریخچه
تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس(kary Mullis) ارائه شده است در این تکنیک یک مولکول DNAمیلیونها بار تکثیر میشود.
ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرات دهی مختلف انجام میگرفت و از آنزیم کلنو بعنوان DNA POLYMERASE استفاده میشد. این آنزیم در اثر حرارت دناتوره میشود و اجبارا با ید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود.
Saiki از آنزیم DNA POLYMERASE مقاوم به حرارت
که اصطلاحا DNA POLYMERASE Taqگفته میشود
استفاده کرد وامروزه واکنش PCR بصورت اتوماتیک انجام
میگیرد .
واکنش زنجیره ای پلیمراز
واکنش ارزان ،سریع و فراگیر ، که به کمک آن محققین توانسته اند آنرا برای بررسی مولکولی میکروبها ، گیاهان ، جانوران، نمونه های باستانشناسی و غیره به کار ببرند
مکانیسم PCR
واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) به سادگی در یک لوله آزمایش با مخلوط کردن DNAبا مجموعه ای از عوامل واکنش دهنده و قرار دادن لوله آزمایش در یک سایکلر حرارتی انجام میشود.
اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد.
در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند ،در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها,آب مقطر جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.
نمونه DNA الگو
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA ، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد.
معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است.
بیش از مقدارتعیین شده، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد.
کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گرددو همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.
آغازگرها( Primer)
پرايمرها قطعات سنتز شده اي از بازهاي آلي اند كه بر اساس قطعه مورد نظر DNA الگو ساخته مي شوند. طول پرايمرها بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند. پرايمرها دو عمل انجام مي دهند. اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از محدوده، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود.
نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blastآنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیگر میتوانند Anneal گردند.
بافر مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند.
از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند. بافر داراي گليسرول میباشد که براي مشهود سازي DNA است.
کاتیونهای دو ظرفیتی: یون منیزیم
یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد واثر متقابل رشته DNA الـگــو و آغـازگـر را افـزايـش مـي دهـد. انواع مختلف آنزیم DNA polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود.
غلظـت كلـريـدمنيـزيـم اثـر زيـادي بـرروي اختصاصي شدن و در نهايت بازده واكنش PCR دارد. غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است.
غلظت بالاتر از مقدارتعیین شده، باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی( شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.
